Центральная фигура картины — доктор Николас Тульп, который показывает собравшимся устройство мускулатуры руки человека.
Труп — Адриаан Адриаанс по прозвищу Арис Киндт (Малыш). В своё время он тяжело ранил в Утрехте тюремного охранника и в Амстердаме избил и ограбил человека. За это 31 января 1632 года он был повешен и передан для публичной аутопсии амстердамской гильдии хирургов.
Также на картине присутствуют старшины Адриан Слабран (второй слева), Якоб де Витт (склонился над трупом, вглядываясь в мышцы руки); лекари Якоб Колевелт (первый слева), Маттейс Калкун (рядом с Витом), Франс ван Лунен (наверху), Якоб Блок (перед ним), Харман Харманс (с листком в руке).
Подобные открытые анатомические уроки были обычным явлением не только в Нидерландах, но и по всей Европе. Они проходили только раз в году, обычно в зимние месяцы, чтобы тело лучше сохранялось, носили торжественный характер и длились как правило несколько дней. Зрителями были коллеги по цеху, студенты, уважаемые граждане и простые горожане.
Рембрандт изобразил на своем полотне персонажей иначе, чем его предшественники. Как правило, персонажи изображались сидящими рядами и смотрящими не на тело, а прямо на зрителя. Художник изобразил хирургов в профиль или полуоборот и сгруппировал их в форме пирамиды, причем главный персонаж расположен не на её вершине.
Помимо этого он намеренно подчеркнул неподдельный интерес собравшихся. Два человека наклонились вперед, их осанка и взгляды указывают на то, что они непременно хотят все увидеть как можно ближе и точнее, при этом с трудом верится в то, что оба хирурга действительно увлеклись происходящим церемониальным действом и пытаются утолить свой научный интерес. Маловероятно, чтобы собравшиеся сидели так близко к месту действа, Рембрандт сконцентрировал происходящее на узком пространстве, окружив мертвеца напряжённым вниманием и жизнью.
Художники до Рембрандта обычно изображали лицо покойного прикрытым платком или стоящим перед ним человеком. Наблюдатели должны были забыть о том, что перед ними находится человек, которого расчленяют на их глазах. Рембрандт придумал промежуточное решение — он изобразил его лицо, наполовину покрытое тенью. Типичная для Рембрандта игра на контрасте света и тени, как будто в полумраке видна umbra mortis — тень смерти.
